微球在流式熒光中的應(yīng)用

流式熒光技術(shù)，是基于美國Luminex公司研制的多功能流式點(diǎn)陣儀（Luminex 100?）開發(fā)的高速度、高通量、并行檢測的生物技術(shù)平臺。它有機(jī)地整和了編碼微球（color-coded  beads）、激光技術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)、最新的高速數(shù)字信號處理器和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則，造就了其無與倫比的檢測特異性和靈敏度，可廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、受體和配體識別分析等研究，得到各權(quán)威機(jī)構(gòu)和醫(yī)學(xué)界高度認(rèn)可，是臨床診斷領(lǐng)域以及生命科學(xué)研究中的一大熱點(diǎn)。
流式熒光技術(shù)是基于激光激發(fā)熒光的發(fā)光類技術(shù)之一，又稱懸浮陣列、液態(tài)芯片。具有三大無與倫比的核心優(yōu)勢：
?    微量標(biāo)本，1檢測，100個(gè)指標(biāo)
?    既能檢測蛋白，又能檢測核酸
?    既能用于臨床，又能用于科研
流式熒光技術(shù)原理：
該技術(shù)的核心是把微小的聚苯乙烯小球（5.6μm）用熒光染色的方法進(jìn)行編碼（微球的顏色是通過兩種熒光染料染色得到的，調(diào)節(jié)兩種熒光染料的比例可以獲得100種不同顏色的微球），然后將每種顏色的微球（或稱為熒光編碼微球）共價(jià)交聯(lián)上針對特定檢測物的探針、抗原或抗體。應(yīng)用時(shí)，先把針對不同檢測物的編碼微球混合，再加入微量待檢樣本，在懸液中靶分子與微球表面交聯(lián)的分子進(jìn)行特異性地結(jié)合，在一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以同時(shí)完成多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng)。最后用Luminex?100進(jìn)行分析，儀器通過兩束激光分別識別編碼微球和檢測微球上報(bào)告分子的熒光強(qiáng)度。因?yàn)榉肿与s交或免疫反應(yīng)是在懸浮溶液中進(jìn)行，檢測速度極快，而且可以在一個(gè)微量液態(tài)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測多達(dá)100個(gè)指標(biāo)。

流式熒光技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：
1、 高通量：僅需微量樣本（10μl），1次檢測，最多100個(gè)指標(biāo)；
2、 高速度：最快可達(dá)10000測試/小時(shí)；
3、 低成本：流式熒光聯(lián)檢的試劑用量少，能有效降低臨床應(yīng)用的試劑成本；
4、 靈敏度高：檢測低限可達(dá)10pg/ml；
5、 重復(fù)性好：每個(gè)指標(biāo)有5000個(gè)反應(yīng)單元，分析100次取平均值；
6、 線性范圍廣：檢測范圍達(dá)6個(gè)數(shù)量級；
7、 無需洗滌：減少誤差來源，且操作簡便、省時(shí)省力。
權(quán)威認(rèn)證：
1997年，Clinical Chemistry雜志刊登專文介紹多功能流式點(diǎn)陣儀及其技術(shù)，并將其譽(yù)為“真正的臨床應(yīng)用型生物芯片”。隨后，運(yùn)用多功能流式點(diǎn)陣儀及其技術(shù)進(jìn)行臨床診斷和基礎(chǔ)研究成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，相關(guān)的研究論文頻頻刊登在Nature、Clinical Chemistry、Clin Biochem、Clin Chem Lab Med、Clin Diagn Lab Immunol、Lancet Oncol、Journal of Molecular Diagnostics、Genome Res、J Proteome Res、Cytometry、Journal of Clinical Microbiology、Clin Dev Immunol、Cancer、Cancer Research等國際權(quán)威學(xué)術(shù)雜志上。2001年7月27日，INOVA公司的ENA系列流式點(diǎn)陣試劑率先通過美國FDA的嚴(yán)格認(rèn)證，標(biāo)志著多功能流式點(diǎn)陣儀及其技術(shù)得到了美國官方的高度認(rèn)可，并由此成為首個(gè)，也是目前唯一得到美國FDA許可用于臨床診斷的多指標(biāo)并行檢測技術(shù)。2005年6月9日，基于xMAP技術(shù)的學(xué)術(shù)論文刊登在當(dāng)日出版的《自然》雜志上，這是學(xué)術(shù)界認(rèn)可一項(xiàng)技術(shù)所能給予的最高榮譽(yù)。2005年11月，為了表彰其對臨床診斷技術(shù)進(jìn)步做出的革命性貢獻(xiàn)，全球科技產(chǎn)業(yè)和行業(yè)研究的權(quán)威機(jī)構(gòu)Frost & Sullivan授予xMAP技術(shù)“2005年度國際臨床診斷技術(shù)革新大獎(jiǎng)”，標(biāo)志著xMAP技術(shù)在國際臨床診斷技術(shù)領(lǐng)域的領(lǐng)軍地位得到了最具權(quán)威的認(rèn)可。
獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)：
液態(tài)芯片的獨(dú)特設(shè)計(jì)使得它擁有常規(guī)檢測方法所不具備的優(yōu)點(diǎn)：
高通量：因?yàn)樵S多種不同熒光編碼的微球可以放在同一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)，所以一次可以同時(shí)檢測多種（100種）生理病理指標(biāo)。這與傳統(tǒng)方法的逐個(gè)檢測相比是一個(gè)質(zhì)的飛躍。
高敏感：液態(tài)芯片最高的靈敏都可達(dá)0.01pg，常規(guī)的酶標(biāo)（ELISA）方法只能是ug級。靈敏度提高10－100倍。液態(tài)芯片技術(shù)應(yīng)用時(shí)，每個(gè)微球上都以共價(jià)結(jié)合的方式包被上許多抗原、抗體或核酸分子。因其參與反應(yīng)的分子多，反應(yīng)基本是在類均相的條件下進(jìn)行的，反應(yīng)充分，產(chǎn)生的信號強(qiáng)。加上使用激光激發(fā)熒光檢測，所以敏感性大大高于常規(guī)的酶標(biāo)、玻璃或膜生物芯片等方法，與發(fā)光的方法比，敏感性等同或略高。
線性范圍寬：檢測的線性范圍比常規(guī)的ELISA方法高10倍以上，可以達(dá)到3-5個(gè)數(shù)量級。檢測濃度范圍可以在pg-μg級。這 明顯優(yōu)于酶免疫分析吸光度2個(gè)數(shù)量級的檢測范圍。
反應(yīng)快速：因?yàn)殡s交或免疫反應(yīng)在懸浮的液相中進(jìn)行，所以反應(yīng)需要時(shí)間短，雜交后常不用清洗就可以直接讀數(shù)，所以檢測效率大大高于 固相雜交，所用時(shí)間從幾小時(shí)縮短到十幾分鐘。
重復(fù)性好：固相芯片不能很好地應(yīng)用于臨床診斷，其中一個(gè)重要的原因是其重復(fù)性差，這是固液雜交方式的芯片目前難以克服的技術(shù)障礙 。但液態(tài)芯片雜交發(fā)生在準(zhǔn)均相的液體環(huán)境中，其結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性非常好。另外，每個(gè)指標(biāo)在一個(gè)反應(yīng)體系中有1000－5000顆相同的微球。檢測時(shí)，抽取其中的100－500顆讀數(shù)，最終的數(shù)據(jù)是取其均值，這樣已經(jīng)把誤差減到最小。而固相芯片每個(gè)指標(biāo)只有 1－2個(gè)數(shù)據(jù)，其數(shù)據(jù)的可靠性就會差很多。
液相環(huán)境更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，也更有利于探針和被檢測物的反應(yīng)。
操作簡便：凡有固體芯片應(yīng)用經(jīng)歷的操作者都會發(fā)現(xiàn)，與現(xiàn)有的大量采用自動(dòng)化技術(shù)的臨床檢驗(yàn)設(shè)備來說，芯片技術(shù)手工操作的步驟非常繁多。但此技術(shù)平臺的整個(gè)反應(yīng)過程只涉及加樣和孵育，最后上機(jī)讀數(shù)，操作步驟少，非常簡單易用。
液態(tài)芯片應(yīng)用
作為最新一代的多指標(biāo)并行檢測技術(shù)平臺，多功能流式點(diǎn)陣儀具有檢測速度快、結(jié)果準(zhǔn)確性高、操作簡便、功能強(qiáng)大、成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，在臨床診斷、健康體檢、生物制藥、生物醫(yī)學(xué)（包括基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)）研究等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，代表著生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展方向。該儀器一經(jīng)推出，便在醫(yī)學(xué)診斷與基礎(chǔ)研究的各個(gè)領(lǐng)域得到了迅速推廣，最近3年來更是以每年高達(dá)600～800臺的速度在迅猛遞增。根據(jù)Luminex公司提供的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，截止2005年底，已有3400多臺多功能流式點(diǎn)陣儀在全球各大權(quán)威實(shí)驗(yàn)室、臨床診斷科、主要的診斷試劑和生物技術(shù)公司、制藥企業(yè)中投入使用。
在液態(tài)芯片平臺上可以開發(fā)許多產(chǎn)品，根據(jù)檢測機(jī)理的不同，可大致分成兩大類：
蛋白芯片：基于的原理是抗原抗體的特異性相互作用，它所檢測的目標(biāo)物是蛋白；
基因芯片：基于的原理是核酸分子雜交，它所檢測的目標(biāo)物是核酸。
液態(tài)芯片技術(shù)平臺及其產(chǎn)品在生命科學(xué)研究的諸多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景：
臨床診斷
基礎(chǔ)研究
免疫學(xué)分析
受體－配體分析
基因組學(xué)研究
蛋白質(zhì)組學(xué)研究
酶與底物相互關(guān)系的研究
新藥開發(fā)
司法鑒定
食品衛(wèi)生監(jiān)督
生物武器防范
國內(nèi)外目前有20余家公司正在研究基于液態(tài)芯片技術(shù)的產(chǎn)品，涉及的領(lǐng)域主要有：
1. 免疫學(xué)或基于免疫學(xué)原理進(jìn)行的分析
- 腫瘤標(biāo)志物檢測
- 細(xì)胞因子檢測
- 組織分型
- 自身免疫病檢測
- 過敏原篩查
- 心血管疾病標(biāo)志物檢測
- 感染性疾病（如乙肝等）的檢測
2. DNA雜交分析
- 感染性疾病病原微生物（如HPV等）的檢測
- SNP檢測
- 基因表達(dá)譜分析
3. 基因及蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析
- 蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用分析
- 蛋白質(zhì)－DNA相互作用分析
4. 高通量藥物篩選平臺
- 高通量、大規(guī)模、并行進(jìn)行藥物篩選
- 直接在蛋白水平尋找靶標(biāo)
- 解釋藥物的作用機(jī)理及毒副作用
5. 受體－配體分析
- 內(nèi)分泌激素分析
6. 酶與底物的相互作用的研究
- 激酶和磷酸化分析
- 金屬蛋白酶類分析