反相高效液相色譜中緩沖體系PH值的選擇

翻譯了一篇很久以前下載的東西，和大家分享一下！在反相高效液相色譜分析中，選擇正確的緩沖液PH值，對可離解的化合物分析的重現性十分重要，不恰當的PH值可能導致不對稱峰，寬峰，分裂峰或肩峰，而尖銳的，對稱的峰是定量分析中獲得低的檢測限以，兩次分析之間較低的相對標準偏差（RSD）和保留時間的高重現性的前提。我們將討論在使用緩沖液時如何選擇緩沖液的PH值，以及如何選擇正確的緩沖體系。什么時候需要緩沖溶液？在反相液相色譜分析中，流動相的PH值一般在2.5－7之間，當被分析物在反相條件下可離解，或樣品的PH值在2.5－7之外時，就需要緩沖液。在反相條件下可離解的化合物一般都有氨基和羧基，他們的Pka在1－11之間，選擇正確的緩沖液PH值可保證可離解的官能團以一種形式存在，離子形式或中性化合物的形式。如果樣品的PH值對柱子有傷害，則緩沖溶液可使其變溫和從而減小其危害。如何選擇緩沖液PH值在選擇緩沖液PH值之前，應先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka兩個PH值單位的，有助于獲得好的、尖銳的峰，從HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高于或低于Pka兩個單位，化合物中99％以一種形式存在，而一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。讓我們通過一個例子來看如何選擇PH值例如苯甲酸圖（一）圖（一）顯示的是它的離子形式和中性化合物的轉變，苯甲酸的Pka等于4.2，理論上由HH公示得知，當溶液PH值等于2.2時，99％的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2時99%的苯甲酸以離子形式存在，所以當緩沖液PH值等于2.2時，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱，表1列出了一般緩沖液和他們的緩沖范圍。從表1知磷酸鹽和檸檬酸鹽緩沖液能用于PH值等于2.2。表1
Phosphate  
Pka12.11.1－3.1
Pka27.26.2－8.2
Pka312.311.3－13.3
Citrate  
Pka13.12.1－4.1
Pka24.73.7－5.7
Pka35.44.4－6.4
Formate3.82.8－4.8
Acetate4.83.8－5.8
Tris（hydroxymethyl）aminomethane8.37.3-9.3
ammonia9.28.2-10.2
borate9.28.2-10.2
diethylamine10.59.5-11.5

當化合物只有氨基時，緩沖體系的選擇十分簡單，大多數氨基化合物在PH值小于9時都被質子化，所以所有PH值在7或更低的溶液均適合應用，你也許會問水的PH值大約是7，為什么還用緩沖鹽，因為緩沖鹽有助于增加方法的可靠性，以及色譜峰的尖銳性，PH值的降低有助于氨基化合物保留的減弱，減小化合物與硅膠表面硅羥基的作用，而使峰更尖銳，從表1 可值，任何緩沖液均可應用于氨基化合物的分析，但我們認為PH值等于3的磷酸鉀鹽最適合用于氨基化合物的分析。在上面兩個例子中，PH＝3的磷酸鉀鹽都能獲得良好的應用，在一般情況下，它是含羧基和氨基化合物分析中最好的緩沖液，并且我們認為在氨基化合物分析中鉀鹽比鈉鹽更好。為離子對試劑選擇緩沖液為應用離子對試劑的方法選擇緩沖液的過程是相似的，離子對試劑例如四丁基銨的鹽，十四烷基磺酸鈉等，在流動相中可與化合物中可離解的官能團配對，在緩沖液中以離子形式存在的化合物就需要應用離子對試劑。應用緩沖液PH值來調節方法選擇性如前面提到的，氨基化合物的保留隨PH的減小而降低，這個特性可以用來調節方法的選擇性，如果兩個化合物共流出，一個含有氨基，適當改變PH值就可以用來分離這一物質對。由于可離解化合物的選擇性依靠PH值，所以變化PH值也可以用來鑒別未知化合物的官能團，如果PH值變小，出峰便快，則化合物中可能存在氨基，當PH變大,化合物出峰很快，或流出在死時間處，化合物可能是一種羧酸，因為羧基離子化后流出大大快于比質子化的中性化合物。總結正確選擇緩沖溶液在反相液相色譜方法中對于優化尖峰，撿出限，以及獲得穩定的保留時間十分重要，如果你知道化合物官能團信息和化合物的Pka值這一過程將十分簡單。