紫外-可見分光光度法的固有標(biāo)準(zhǔn)

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摘要：本文對以氧化鈥溶液為近紫外和可見光譜區(qū)的波長參考物的多通道研究結(jié)果進(jìn)行了綜述。

Intrinsic Standards for UV-VIS Spectrophotometry

John C. Travis, David L. Duewer, and Marc L. Salit

Abstract:The results of a multicenter study into the use of holmium oxide solution as a wavelength reference material in near UV and VIS is reviewed.

21 世紀(jì)的全球銷售市場和國際執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為適合作參考的物質(zhì)提供了平穩(wěn)的需求。國家計(jì)量研究所（NMIs），如NIST（Gaithersburg, MD）通常都有為這類參考物提供具有追蹤能力的（traceability）后臺支撐，這里的追蹤能力指的是“某儀器測定結(jié)果或標(biāo)準(zhǔn)值的屬性，它通過一條可與所有規(guī)定的不確定性進(jìn)行比較的完整通道與國家或國際的標(biāo)準(zhǔn)相聯(lián)系”。此處的測定結(jié)果或標(biāo)準(zhǔn)值能與規(guī)定的參考相關(guān)聯(lián)，這里的參考通常是國家或國際的標(biāo)準(zhǔn)，它通過一條完整的鏈比較所有規(guī)定的不確定性[1]。將參考物傳送到終端用戶的有效系統(tǒng)是開始于響應(yīng)和競爭性二級標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)者，這些標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)者具備證明他們產(chǎn)品有追蹤能力。通過使用固有標(biāo)準(zhǔn)可使效率進(jìn)一步提高，在此以波長標(biāo)準(zhǔn)及其吸收標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用為例加以說明。

        圖1 左側(cè)說明給出了借助一個(gè)二級人工波長標(biāo)準(zhǔn)從SI 米到終端用戶的傳統(tǒng)追蹤通道。正如圖1右側(cè)所示，通過固有（數(shù)據(jù)）標(biāo)準(zhǔn)的使用，可以縮短追蹤通道中接線的數(shù)目。固有標(biāo)準(zhǔn)是“基于充分表征的物理學(xué)原理、自然界的基本常數(shù)或物質(zhì)的不變屬性以及如果經(jīng)過合理的設(shè)計(jì)、表征、操作、監(jiān)測維護(hù)而制得的理想、穩(wěn)定、精確、準(zhǔn)確的測定標(biāo)準(zhǔn)”[2]。10% （體積分?jǐn)?shù)）的高氯酸中含40g/L 氧化鈥溶液所產(chǎn)生的紫外- 可見吸收譜帶適合作波長標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)核定的作為固有標(biāo)準(zhǔn)的氧化鈥溶液聲明將鏈中頂部的節(jié)點(diǎn)鎖定為單階可追溯到米文件。盡管固有的數(shù)據(jù)已經(jīng)公布且被同行審查過，但為了通過已發(fā)表的和被審查過的內(nèi)在數(shù)據(jù)來聲明其維護(hù)追蹤能力，二級標(biāo)準(zhǔn)品生產(chǎn)者只需根據(jù)說明生產(chǎn)溶液并將其密封于試管或安瓶內(nèi)即可。

1 氧化鈥溶液為波長參考物

        上述的氧化鈥溶液于1985年由NIST（當(dāng)時(shí)所謂的國家標(biāo)準(zhǔn)局，或稱NBS）于1985年作為標(biāo)準(zhǔn)參考物（SRM）2034 引進(jìn)作為標(biāo)準(zhǔn)參考物（SRM）2034，。其中有14 條經(jīng)核定的波段作為被核定為透光率最小值（在空氣中波長單位納米）的光譜位置，見圖2[3，4]中數(shù)字所標(biāo)明的波段。12 批這類標(biāo)準(zhǔn)（200-250 單位/ 每批）于1985-2002 之間生產(chǎn)，使用的波段最低值，最初分配在1985 系列的儀器光譜帶寬的（SBM）6 個(gè)值。

        基于最初的兩個(gè)波長比較使運(yùn)用[5,6]，SRM 2034核定值的不確定性為2001 和2002批次所修正。這些研究同時(shí)證明了兩個(gè)完全獨(dú)立的氧化鈥溶液形式組成的可比較性和多通道中心方法對于核定值再次分布給透過率最低點(diǎn)的優(yōu)越性[7]。

2 多通道中心研究
        作為最初的比較結(jié)果，14 個(gè)國家的22 臺儀器（見表1）已參與另一項(xiàng)研究用于將新的核定值和不確定性分配給14 個(gè)最初核定的波段光譜位置，以及圖2 中字母所標(biāo)明的4 條另外的波段8[8]。除了將多通道中心測定用于SRM 2034的2002 系列樣品外，NIST 主體實(shí)驗(yàn)室對于由其他生產(chǎn)商所生產(chǎn)的6 種氧化鈥溶液樣品和11 種NIST SRM 2034用于支持固有標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)所要求的普遍性的優(yōu)先系列試樣作了進(jìn)行附加補(bǔ)充比較。在NIST 中的補(bǔ)充研究包括濃度和溫度的相關(guān)互依賴性。為了作為起著對合適的吸光光度法的固有內(nèi)在波長標(biāo)準(zhǔn)的氧化鈥溶液中18 條波段的聲明，在別處對多通道中心和補(bǔ)充結(jié)果在別處做了詳細(xì)說明。

3 儀器校正
        在多通道中心研究中要求每個(gè)參與者提供他們所使用儀器的原始刻度的獨(dú)自的立波長校正。圖3 給出了上述校正的首選方法，該圖給出表明了原子光譜線的指示位置和儀器指示波長間的偏差相對于儀器指示波長的函數(shù)關(guān)系。偏差的定義為“譜線中心指示的波長值減去譜線中心的已知值，正如原子光譜線評估表所報(bào)到的[9]”。低次多項(xiàng)式名（如拋物線所示）與這類偏差數(shù)據(jù)擬合提供了一平滑的偏差校正函數(shù)用以校準(zhǔn)顯示在儀器上的數(shù)據(jù)的波長刻度。平滑擬合曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的較大分散性大于由，用干涉測量法測定的原子線位置的不準(zhǔn)確度或測量儀器的精確度所還不能解釋的。圖3 中的誤差條形圖代表置信區(qū)間為95% 的峰位置重現(xiàn)性，譜線位置已知值的不準(zhǔn)確度比峰位置重現(xiàn)性小得多。擬合的分散常被視為看作代表現(xiàn)儀器器件的光學(xué)隊(duì)列序列中的機(jī)械缺陷，殘數(shù)擬合的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差被視為校正一臺儀器能力的指示器。校正不準(zhǔn)確度的數(shù)量級在±0.1 nm 通常為認(rèn)為是研究級的分光光度計(jì)所引證。

        每臺參與的儀器都得到一張類似圖3 的顯示氧化鈥溶液在3 段光譜帶寬的所有被測波段偏差的示意圖并顯示偏差，即測得的波段位置和公論值的差別，公論值為氧化鈥溶液在3 段光譜帶寬的所有被測的波段。對于較窄的兩條帶寬，偏差值通常集中在由原子線校正經(jīng)驗(yàn)所預(yù)測的范圍內(nèi)。然而，如圖4所給出顯示的幾種參與的儀器，對于3.0nm 光譜帶寬，偏差接近0.3nm 的情形是少見的。這些結(jié)果（和在NIST 所做的支持的實(shí)驗(yàn)）的最終結(jié)論是只要光源溢出狹縫和視覺場范圍，入射口狹縫則將決定單色器輸入的光軸。對于一個(gè)研究用實(shí)驗(yàn)分光光度計(jì)，寬物理狹縫要求回到3nm 譜帶寬度時(shí)，光源可以不溢出狹縫或成像不超出狹縫。在這種情形下，在決定單色器的入射軸時(shí)，光源的準(zhǔn)直比物理狹縫的中心更重要。對于每一個(gè)用于測定原子波長的記錄燈，以及對在正常運(yùn)行儀器的連續(xù)燈（鎢燈和/或氘燈），該效果可導(dǎo)致不同的有效波長的校正。事實(shí)上，從圖4 中的一些結(jié)果有可能以覺察出鎢燈（＞350 nm）和氘燈（＜350 nm）的校正差別。
        圖4 中一有趣的隱義是顯示數(shù)據(jù)的儀器通過使用基于吸收的波長標(biāo)準(zhǔn)校正比以原子線校正的方式更能得到一致的波長標(biāo)度。從另一方面而言，一致性并不是精確性的必然。在一致性數(shù)值中如何估算它的不確定性，特別是在研究級儀器無法準(zhǔn)確校準(zhǔn)的3.0nm 光譜帶寬處實(shí)驗(yàn)級儀器無法被準(zhǔn)確校準(zhǔn)。這就是多通道中心方法的長處，因?yàn)樾Ｕ笈績x器的困難之處似乎是它們的“隨意性”。因此，當(dāng)參與者的數(shù)量增加時(shí)，平均值越來越成為真值有用的估價(jià)者。盡管單個(gè)測量的離差大于校正某一臺校正儀器的常規(guī)估算能力，事實(shí)上平均值的離差更小，因?yàn)樗臉?biāo)度與參與者數(shù)量的平方根成反比。盡管圖4 中顯示出了個(gè)體的變化，事實(shí)上幾乎所有核定值的最終擴(kuò)展的不準(zhǔn)確度（置信區(qū)間為95%）落在常規(guī)的± 0.1 nm 范圍內(nèi)。

4 將延伸結(jié)果擴(kuò)展到具有大譜帶寬度的儀器
        對被用于更寬的光譜帶寬的固有標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核定時(shí)，其所遇到的困難通常比實(shí)驗(yàn)級的儀器更大、更嚴(yán)重。在沒有儀器影響的情況下，通過物質(zhì)的固有光譜，對于某一給定的光譜帶寬，一潛在的解決辦法是通過卷積理論三角的狹縫函數(shù)計(jì)算生成展寬的固有光譜。鑒于此目的，在0.1nm光譜帶寬處所獲得實(shí)驗(yàn)光譜充分展現(xiàn)表示了一個(gè)不變形的分子光譜，以用普通的電子制表軟件功能很容易計(jì)算得到理論預(yù)測展寬的光譜，詳解如圖5 所示。

        盡管不易看出圖上的標(biāo)度，但由于譜帶形狀的不對稱性，大多數(shù)吸收譜帶的外觀的最小值隨光譜帶寬移動(dòng)是明顯的。對于0.1~10.0 nm 范圍內(nèi)以0.1 nm 增量的光譜帶寬以卷積方式產(chǎn)生的光譜，其已被用于與基于計(jì)算機(jī)的譜帶最小單元結(jié)合產(chǎn)生彈道曲線。這些彈道曲線與測得的值具有很好的一致性，直到最大的實(shí)驗(yàn)譜帶寬度3.0 nm 還具有很好的一致性。因此，既定的固有值被定為核定值超出3.0 nm 和3.0~10.0 nm 的信息值。這些語義的差別來源于插值計(jì)量學(xué)規(guī)則而不是實(shí)驗(yàn)結(jié)果的推斷。然而，人們希望更寬的譜帶寬度的量以滿足這類儀器執(zhí)行有效性的需求。
5 實(shí)際分布和使用
        將氧化鈥溶液的透射光譜譜帶的最小值定義為固有的波長標(biāo)準(zhǔn)減緩輕了在SRM 2034 批次之后NIST 生產(chǎn)批量的任務(wù)，且生產(chǎn)將真正隨2004 系列終止。但是為了應(yīng)用固有標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)的結(jié)果，終端用戶將依舊需要人工生產(chǎn)溶液。商品化的及通過其它的NMIs 得到的溶液在研究中被列出以提供能與SRM 2034 相比較的結(jié)果。只有兩個(gè)例子在某一波段的光譜位置處可檢測出不同，這兩例氧化鈥的質(zhì)量濃度明顯不同（其中一個(gè)為20 g/L，另一個(gè)標(biāo)為60 g/L），生產(chǎn)商和終端用戶通過目視比較光譜并同預(yù)期的對比可以核驗(yàn)定出某一樣品是否合適，例證如圖2和圖5所示。許多儀器的波段定位（或拾峰）由儀器的軟件提供并按軟件說明使用，程序的適宜性可由偏差曲線所觀察到的結(jié)果判斷，后者可通過將實(shí)驗(yàn)所測得波段位置減去核定值，以核定值作為指示波長的函數(shù)繪制曲線（對于具有合適譜帶寬度的波段），用戶可以遵照下面幾條路線：
        1. 可接受的。如果采納由UV光譜范圍的美國藥典（USP）[10]，歐洲藥典（Ph. Eur. ）[11]，the Deutches Arzneibuch（DAB）[12]，以及治療貨物管理局（TGA）[13]推薦的公差（對于全刻度）值±0.1 nm，則能劃出一條水平線在±1 nm 處橫截偏差曲線的縱軸，觀察是否所有的偏差都落在所定義的波段內(nèi)。很顯然，他們對所有的波長偏差對在圖3 和圖4 中所指示的儀器都有效。當(dāng)某些偏差接近公差極限時(shí)，切割點(diǎn)不太清析，此時(shí)必須考慮核定值的不準(zhǔn)確度、儀器的精度以及簡化的公差。但是在同專用儀器的準(zhǔn)確度（上述執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)在可見光譜范圍內(nèi)的分析公差為±3 nm）相比，分析公差常常是大方的（generous），從而進(jìn)入到下一個(gè)方法。
        2. 叫工程師來調(diào)整波長刻度。如果有好幾個(gè)偏差點(diǎn)開始接近公差極限時(shí)，此時(shí)應(yīng)該和工程師聯(lián)系而不是擔(dān)憂心誤差傳播等等諸如此類的問題。
        3. 使用擬合偏差函數(shù)進(jìn)行波長校正。波長偏差數(shù)據(jù)的擬合所提供的平滑分析表達(dá)式可以將儀器設(shè)置為校正的波長或糾正掃描的波長軸。舉例來說，如果分析方法需要在波長280 nm 處測試，而擬合偏差曲線在280 nm 處的偏差指示為+0.55 nm，那么儀器的指示波長將被設(shè)置為280.55 nm 從而能在真實(shí)波長280 nm 處獲得吸收讀數(shù)。需要簡化處理關(guān)系式“偏差= 指示的- 真實(shí)的”，從而發(fā)現(xiàn)“指示的= 真實(shí)的+ 偏差”。
        總之，選項(xiàng)是確認(rèn)（如果必要，帶有維修）或校正。此處線與線間的暗隱是計(jì)算機(jī)或微處理器面板控制現(xiàn)代儀器的事實(shí)。如果應(yīng)用程序具有這種特征的話，便有可能在軟件中重新校正波長軸。這一選擇有益于進(jìn)行儀器手動(dòng)掃描或?qū)崿F(xiàn)在線技術(shù)支持。
6 結(jié)論
        盡管氧化鈥溶液在很多方面提供了充足的波長校正范圍，然而在額外的光譜區(qū)，其它稀土元素有效地提供了銳的吸收波段。由政府化學(xué)家（LGC，Teddington, U.K.）提供的稀土混合物，包括氧化鈥和氧化釹，氧化物將波長范圍擴(kuò)展到219～865 nm[14]。圖6給出了表明釹元素加入一些孤立的波段到鈥元素的光譜中，并與鈥元素的一些波段產(chǎn)生干擾。近來的商品化稀土溶液在210-254 nm 之間提供5 個(gè)校正波段，該波段區(qū)域是一個(gè)重要的光譜區(qū)域且氧化鈥溶液并不提供該項(xiàng)服務(wù)[15]。這些額外的稀土過渡元素代表了內(nèi)在固有波長標(biāo)準(zhǔn)物的替補(bǔ)，需要分別在時(shí)間、環(huán)境微擾和核定值的協(xié)作指定方面需要作進(jìn)一步研究波段位置的穩(wěn)定性。

        紫外- 可見吸收分光光度計(jì)的標(biāo)度是基于一比值（光的透射率），因此它對一些潛在的誤差源是不敏感的，然而需要確認(rèn)以保證儀器正常運(yùn)行。盡管普遍使用灰色玻璃和含金屬的熔融硅中等密度濾光片，但是在固定的時(shí)間間隔內(nèi)做單個(gè)的校驗(yàn)是低效而麻煩的。重鉻酸鉀作為UV 的實(shí)際固有標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，吸收峰分別在257 nm 和350 nm 被驗(yàn)證，吸收谷分別在235 nm 和313 nm 被驗(yàn)證。對于特定濃度和溶劑的目標(biāo)值和寬容的generous 公差極限，由Ph. Eur.，DAB，TGA，英國藥典（BP）[16]和日本藥典（JP XIV）[17]指定。ASTM 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則E 295-02[18]提供預(yù)期的吸收值，該值由已知的NIST SRM 935a 固有的吸收率計(jì)算得到（以晶體重鉻酸鉀晶體作為紫外吸收的的標(biāo)準(zhǔn)）[19]，NIST SRM 935a 只給予說明性的公差。重鉻酸鉀吸收率的國際值的指定行為或許是有利的。
        迄今，還沒有公認(rèn)的候選物質(zhì)對于整個(gè)UVVIS 光譜區(qū)域范圍提供固有的吸收。使用公認(rèn)的、穩(wěn)定的氧化鈥溶液的光譜來同時(shí)校正/ 確定波長軸和吸收軸這一方法是有趣的且有前景的。有必要用計(jì)算機(jī)將被校驗(yàn)的光譜和實(shí)驗(yàn)測定的光譜進(jìn)行集中全譜擬合以提供基線修正、波長校正、譜帶寬度測定以及吸收值的確定。
        最近由NIST 化學(xué)科學(xué)和技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（CSTL）發(fā)起的導(dǎo)航研究為充分地generous 寬容的吸收公差證明校驗(yàn)原理這一概念。這一方法將為240- 650 nm 和0～1 范圍的吸光度單位提供簡單而有效的作用范圍。使用更高濃度的溶液或吸收光程可以達(dá)到更高的吸光度值。
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